生物化學綜合實驗習題解答精選
綜合實驗一 蛋白質的濃度測定—Bradford法
1．制作標準曲線及測定樣品時，為什么要將各試管中溶液縱向倒轉混合？
答：(1)由于蛋白與考馬斯亮藍G-250染料的結合能力不同，縱向倒轉混合，充分反應。
(2)標準蛋白加入的量與考馬斯亮藍G-250的體積相差懸殊，縱向倒轉混合，充分反應。
2．查閱相關資料、文獻，舉例說明測定蛋白質的濃度的方法有哪幾種，并說明各自的優(yōu)缺點。 答：主要的以下幾種：
（1）微量凱氏（Kjeldahl）定氮法，優(yōu)點是測定準確率高，可測定不同形態(tài)的樣品。 缺點是測定過程繁瑣。
�。�2）雙縮脲法（Biuret法）
優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定。
�。ǎ常〧olin—酚試劑法（Lowry法）
此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產(chǎn)生深藍色的原因是在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。
(４）考馬斯亮蘭法（Bradford法）
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色。染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在波長為595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。
優(yōu)點：a. 靈敏度高。b 測定快速、簡便，只需加一種試劑。c. 干擾物質少。
缺點： a 由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。b.物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。c. 標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。
綜合實驗二 （1）酸性磷酸酯酶的提取
1、酸性磷酸酯酶在生物體內(nèi)的作用是什么？
答：酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase，E.C.3.1.3.2)存在于植物的種子、霉菌、肝臟和人體的前列腺之中，能專一水解磷酸單酯鍵，如水解磷酸苯二鈉生成苯酚和無機磷。
生物化學綜合實驗習題解答
綜合實驗二 （2）酶促反應進程曲線的制作和初速度的測定
1、為什么酶活力應該在進程曲線的初速度時間范圍內(nèi)進行？
答：要進行酶的活力測定，首先要確定酶的反應時間。酶的反應時間并不是任意規(guī)定的，應該在初速度范圍內(nèi)進行選擇。隨著反應時間的延長，曲線趨于平坦，曲線的斜率不斷下降，說明反應速度逐漸降低。反應時間延長以后底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應加強。因此，要真實反映出酶活力的大小，就應該在產(chǎn)物生成量與酶反應時間成正比這一段時間內(nèi)進行初速度的測定。換言之，測定酶活力應該在進程曲線的初速度時間范圍內(nèi)進行。
綜合實驗二 (3) 酶的活力測定
1、酶活力測定中為什么各樣品與底物測定的時間要嚴格一致？
答：本實驗中用磷酸苯二鈉為底物。磷酸苯二鈉經(jīng)過酸性磷酸酯酶作用，水解以后即生成酚和無機磷，其反應式如下：
O
||
C6H6-O-P-ONa + H2O ≒ C6H6-OH + Na2HPO4
|
ONa
由上式可見，當有足夠量的底物磷酸苯二鈉存在時，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的產(chǎn)物酚和無機磷也越多。反應速率只在反應的最初一段時間范圍內(nèi)保持恒定。隨著時間的延長，底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的升高，使逆反應加強。
綜合實驗二 (4) 酸性磷酸酯酶分子量的測定SDS-PAGE電泳法
1、為什么要在樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的甘油溶液？甘油及溴酚蘭的作用分別是什么？
答：加少許溴酚蘭的目的是作指示劑，用來反映在電泳的過程中樣品蛋白質遷移的長度。加入甘油的作用是甘油的密度較大，對樣品中的蛋白質起沉淀作用。
2、影響遷移率的因素有哪些？
答：①SDS的濃度，溶液中的SDS的總量至少要比蛋白質的量要高三倍，一般高達10倍以上。 ②溶液的離子強度，溶液的離子強度應較低，最高不能超過0.26，在低離子濃度中SDS單體具有較高的平衡濃度。
�、鄱蜴I是否完全被還原，只有在蛋白質分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原的條件下才能準確測定。在有些情況下，還需要進一步將形成的巰基烷基化。
�、苊看螛悠窚y定必須同時做標準曲線，而不得利用另一塊電泳的標準曲線。
生物化學綜合實驗習題解答
綜合實驗三 動物組織DNA提取及純度檢測
1、DNA提取的原理是什么？
答：真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內(nèi)，提取DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離和保持DNA分子的完整。提取DNA過程是將分散好的組織細胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿或異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。
2、試分析DNA樣品不純的原因？
答:①裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解，②各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解，③取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾，④異丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。
綜合實驗四 大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及外源DNA的'轉化
1、氨芐青霉素篩選轉化子的原理是什么？
答：外源DNA轉化是以 E.coli DH5α 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài)，然后與 pUC18質粒共保溫實現(xiàn)轉化。 pUC18質粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，使接受了該質粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性。將經(jīng)過轉化后的全部受體細胞經(jīng)過適應稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉化體才能存活，而未受轉化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。
2、影響轉化的因素有哪些？
答：(1）細胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉接或儲于4℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時，細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，密度過高或不足均會影響轉化效率。
�。�2）質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉化效率就會降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。
�。�3）試劑的質量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。
�。�4）防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行， 所用器皿， 如離心管， tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染， 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入。
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